Автореферат – исходники LaTeX’a

Результирующий pdf-файл (объединенный из двух с помощью плагина для среды Automator ‘Combine pdf pages’, MacOS X) можно скачать отсюда.

%! program = pdflatex

Файл title.tex

\documentclass[10pt,a5paper,twoside]{article}

\usepackage{booktabs}
\usepackage{array}
\usepackage{topcapt}
\usepackage{longtable}
\usepackage{tabularx}
\usepackage{textcomp}
\usepackage{amsmath}
\usepackage[russian]{babel}
\usepackage[cp1251]{inputenc}
\usepackage{graphicx}
\usepackage{letterspace}
\usepackage{float}
\usepackage{caption}

\renewcommand{\baselinestretch}{1.23}
\newcommand{\pseudo}{$\Psi$}

\newcommand{\zz}{\rule{4mm}{.6pt}}

\newfloat{scheme}{tb}{sch}

\oddsidemargin=-13.4mm
\evensidemargin=-9.2mm
\topmargin=-25mm
\textwidth=12cm
\textheight=18cm
\sloppy

\author{Баранов А. В.}

\begin{document}
\Russian

\begin{titlepage}

\vspace{5mm}
\begin{flushright}
\emph{На правах рукописи}
\end{flushright}

\vspace{20mm}

\begin{centering}

{\bf БАРАНОВ Александр Владимирович}

\vspace{10mm}

{\bf РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СИНТЕЗА ПСЕВДОПЕПТИДОВ И МОНОМЕРОВ ПЕПТИДНО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ}

\vspace{10mm}

02.00.10 --- Биоорганическая химия

\vspace*{\fill}

{\bf Автореферат} \\
диссертации на соискание ученой степени \\
кандидата химических наук

\vspace*{\fill}

{\bf Москва --- 2008}

\end{centering}
\end{titlepage}

\clearpage
\thispagestyle{empty}

\noindent
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.~В.~Ломоносова.

\vspace{5mm}

\noindent
\begin{tabular}[l]{ll}
{\bf Научный руководитель} &  академик РАМН, \\
& доктор химических наук, \\
 & профессор \\
 & {\bf Швец Виталий Иванович} \\ [5mm]
{\bf Официальные оппоненты} & доктор химических наук, \\
& профессор \\
& {\bf Юркевич Александр Морисович} \\ [3mm]
& кандидат химических наук\\
& {\bf Тевяшова Анна Николаевна}\\ [5mm]
{\bf Ведущая организация} & Институт молекулярной генетики РАН\\
\end{tabular}

\vspace{5mm}

\noindent
Защита состоится 23 июня 2008 года в \zz:\zz ч. на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной академии тонкой химической технологии им.~М.~В.~Ломоносова по адресу: 119571, г.~Москва, проспект Вернадского, д.~86.

\vspace{5mm}

\noindent
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Государственной академии тонкой химической технологии им.~М.~В.~Ломоносова. 

\vspace{3mm}

\noindent
С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте \texttt{www.mitht.ru}.

\vspace{5mm}

\noindent
Автореферат разослан <<\zz>> мая 2008 года.

\vspace*{\fill}

\noindent
\begin{tabular}{lr}
Ученый секретарь Диссертационного Совета &\\
кандидат химических наук, & \\
старший научный сотрудник & А.~И.~Лютик\\
\end{tabular}

\clearpage

\end{document}

Файл main.tex

%! program = pdflatex

\documentclass[10pt,a5paper,twoside]{article}

\usepackage{booktabs}
\usepackage{array}
\usepackage{topcapt}
\usepackage{longtable}
\usepackage{tabularx}
\usepackage{textcomp}
\usepackage{amsmath}
\usepackage[russian]{babel}
\usepackage[cp1251]{inputenc}
\usepackage{graphicx}
\usepackage{letterspace}
\usepackage{float}
\usepackage[skip=0pt,format=hang,justification=raggedright,font=small,labelfont=it]{caption}

\renewcommand{\baselinestretch}{1.25}
\newcommand{\pseudo}{$\Psi$}

\newcommand{\zz}{\rule{4mm}{.6pt}}

\newfloat{scheme}{tb}{sch}

\oddsidemargin=-13.4mm
\evensidemargin=-9.2mm
\topmargin=-25mm
\textwidth=12cm
\textheight=18cm
\sloppy

\author{Баранов А. В.}

\begin{document}
\Russian
\input avt.tex

\end{document}

Файл avt.tex

\section*{Общая характеристика работы}

\footnotetext[1]{В руководстве работой принимала участие к.х.н., доц. Кириллова~Ю.~Г. 

Список используемых сокращений:
НК~--- нуклеиновая кислота,
ПНК~--- пептидно-нуклеиновая кислота,
ОЗ~ПНК~--- отрицательно заряженная пептидно-нуклеиновая кислота,
All~--- аллил,
Boc~--- {\it трет}-бутилоксикарбонил,
\textsuperscript{t}Bu~--- {\it трет}-бутил,
Bzl~--- бензил,
Cbz~--- бензилоксикарбонил,
DCM~--- дихлорметан,
DMF~--- диметилформамид,
DEAD~--- диэтилазодикарбоксилат,
DME~--- диметоксиэтан,
ECF~--- этилхлорформиат,
IBCF~--- {\it изо}-бутилхлорформиат,
Im~--- имидазол,
NMM~--- {\it N}-метилморфолин,
Ns~--- {\it орто}-нитробензолсульфонил,
Ph~--- фенил,
Piv~--- пивалоил,
Py~--- пиридин,
STAB~--- триацетоксиборгидрид натрия,
TEA~--- триэтиламин,
THF~--- тетрагидрофуран,
TFA~--- трифторуксусная кислота.}

{\bf Актуальность проблемы.}
Создание аналогов природных пептидов, содержащих в своем составе восстановленную пептидную связь (\pseudo), представляет интерес с точки зрения изучения их взаимодействия с протеолитическими ферментами с целью применения данных пептидомиметиков в медицине. В связи с изучением сигнальных пептидов мозга особый интерес представляют псевдопептиды типа ProGly-\pseudo-Pro. Регулярное чередование пептидной и псевдопептидной связи является основой для другого важного класса аналогов биополимеров~--- пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК). Такая модификация природной пептидной связи позволяет получать не подверженные биодеградации структуры, подобные НК, что в сочетании с аффинностью к олигонуклеотидам определяет их перспективность в различных областях биотехнологии.

Таким образом, является актуальной проблема поиска наиболее оптимального подхода к созданию псевдопептидной связи, а также рациональных способов дериватизации псевдопептидов и синтез на их основе новых биологически активных соединений.

Результаты, полученные ранее в нашей лаборатории, позволяют говорить о высоком сродстве декамеров ОЗ~ПНК с регулярной структурой, построенной из  тиминсодержащих мономеров на основе псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu, к комплементарным олигонуклеотидам, и о возможности управлять степенью этого сродства посредством изменения состава буферной среды (\emph{Боярская, 2007}). Таким образом, актуальной становится задача разработки путей синтеза новых мономеров, содержащих остатки других нуклеиновых оснований, и
препаративное получение уже синтезированных ранее мономеров для получения олигомеров ОЗ~ПНК.

Данная работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Биотехнологии МИТХТ им.~М.~В.~Ломоносова в рамках госбюджетной темы 1Б-5-356 <<Исследования липидов, нуклеозидов, пептидов, ретиноидов методами биотехнологии и химического синтеза с целью создания препаратов медицинского назначения (онкологические и вирусные болезни, возрастные патологии)>>, а также в рамках РНП <<Развитие научного потенциала высшей школы>> (проект \No~2.1.1.3243), госконтрактов с Роснаукой \No\No~02.445.11.7355, 02.512.11.2144, 02.522.11.20011.

\bigskip
\noindent
{\bf Цель настоящего исследования}
заключалась в синтезе псевдопептидов и их производных. 

\bigskip
\noindent
{\bf Основными задачами} настоящего исследования явились:
\begin{enumerate}
\item Оптимизация подходов к созданию псевдопептидной (\pseudo) связи между остатками различных по строению аминокислот и синтез псевдопептида состава ProGly-\pseudo-Pro.
\item Разработка и препаративный синтез новых цитозинсодержащих мономеров ОЗ~ПНК из псевдопептидов различного строения.
\item Подтверждение структуры тимин-, цитозин- и аденинсодержащих мономеров ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu.
\end{enumerate}

\bigskip
\noindent
{\bf Научная новизна и практическая ценность работы.}
Разработан новый метод восстановления производных дикарбоновых $\alpha$-аминокислот до соответствующих $\beta$-аминоспиртов, являющихся амино-, карбокси- и гидроксилсодержащими трифункциональными хиральными синтонами с ортогональными защитными группами. Впервые синтезированы два защищенных производных псевдопептида ProGly-\pseudo-Pro. В ходе этого этапа работы была показана принципиальная возможность конструирования псевдопептидов, содержащих остатки пролина.

В результате проведенной работы найден и оптимизирован способ получения, впервые осуществлен синтез в препаративных количествах, а также полностью охарактеризованы два цитозинсодержащих мономера ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu.
Разработанный подход был применен к синтезу ранее полученных двух тиминсодержащих мономеров ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu и одного аденинсодержащего мономера ОЗ~ПНК на основе псевдопептида Gly-\pseudo-Glu. В результате работы были показаны преимущества разработанной схемы по сравнению с использовавшейся ранее для синтеза различных мономеров ОЗ~ПНК.

Методами двумерной ЯМР-спектроскопии изучена региоселективность реакции алкилирования нуклеиновых оснований (цитозина, тимина и аденина) бромацилированными псевдопептидами Gly-\pseudo-Glu и Glu-\pseudo-Gly.

\bigskip
\noindent
{\bf Основные положения, выносимые на защиту:}
\begin{enumerate}
\item Изучение восстановления производных дикарбоновых $\alpha$-ами\-но\-кислот.

\item Препаративный синтез псевдопептида ProGly-\pseudo-Pro.

\item Препаративный синтез двух новых цитозинсодержащих мономеров ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu.

\item Оптимизация схемы синтеза двух тимин- и одного аденинсодержащего мономера ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu. 

\item Изучение региоселективности реакции алкилирования бромацилированными псевдопептидами Gly-\pseudo-Glu и Glu-\pseudo-Gly тимина и защищенных цитозина и аденина методами двумерной ЯМР-спектроскопии.
\end{enumerate}

\bigskip
\noindent
{\bf Публикации и апробации работы.} По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи и 3 тезисов на Всероссийских и международных конференциях. Результаты настоящего исследования были представлены на следующих научных конференциях:
Научно-техническая конференция молодых ученых МИТХТ им. М. В. Ломоносова <<Наукоемкие химические технологии>> (2007, Москва),
Третий съезд общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова (2005, Москва),
Московский международный конгресс <<Биотехнология: состояние и перспективы развития--2005>> (2005, Москва).

\bigskip
\noindent
{\bf Структура диссертации и объем работы.}
Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 93 источника. Диссертация иллюстрирована 31 рисунком и содержит 8 схем и 6 таблиц.

\vspace*{\fill}

\section*{Результаты работы и их обсуждение}

Восстановленная амидная связь \pseudo(CH$\mathrm{_2}$-NH) встречается в различных структурах, среди которых следует выделить пептидомиметики и пептидно-нуклеиновые кислоты. Первые представляют собой аналоги природных пептидов, в которых произведена структурная замена пептидной связи на \pseudo-связь, используемые для изучения механизмов действия различных ферментов. Вторые являются НК-миметиками, в которых основой для мономерного звена служит дипептид с восстановленной амидной связью.

\subsection*{Синтез псевдопептидов}

Существует три основных метода создания псевдопептидной связи \pseudo(CH$\mathrm{_2}$-NH): реакция восстановительного аминирования с участием альдегидов и аминов в присутствии мягких восстановителей ({\it Ahmed, 1996}), реакция Мицунобу между спиртами и модифицированными с помощью электроноакцепторных заместителей по NH$\mathrm{_2}$-группе аминами ({\it  Mitsunobu, 1981}), а также восстановление уже имеющейся амидной (пептидной) связи. В нашей лаборатории широко используют первые два метода для создания коротких псевдопептидов с целью их дальнейшей дериватизации до мономеров ОЗ~ПНК и аналогов биологически активных пептидов. 

\clearpage

\subsubsection*{Изучение стадии восстановления защищенных дикарбоновых аминокислот}

Восстановление защищенных $\alpha$-аминокислот до соответствующих $\beta$-аминоспиртов является ключевой стадией в синтезе многих аналогов биологически активных пептидов.
Из $\beta$-аминоспиртов получают важные в химическом отношении синтоны: $\alpha, \alpha'$-диаминодикарбоновые кислоты% \cite{Truchot}
, 3-(S)-амино-$\gamma$-бутиролактон%\cite{sibrian_vazquez}
, (S)-$\gamma$-фторлейцин%\cite{truong}
, различные $\beta$-аминокислоты через $\beta$-иодамины%\cite{caputo}
.
В случае использования дикарбоновых аминокислот возможно получать амино-, карбоксил- и гидроксилсодержащие три\-функцио\-нальные оптически активные синтоны, использующиеся, в частности, в синтезе мономеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот (\emph{Боярская, 2005})%\cite{nata_tetlet, nata_dan06}
.
Стандартный способ  селективного восстановления $\alpha$-карбоксильной группы до спиртовой действием 1~М раствора борана в THF (\emph{Схема~1}) позволяет получать такие соединения, однако невысокий выход (не более 50\%), необходимость осуществления реакции при $-78$\textcelsius, токсичность и высокая стоимость используемого реагента заставили нас искать более дешевый и воспроизводимый способ синтеза $\beta$-аминоспиртов {\bf 3} из производных дикарбоновых аминокислот {\bf 1}.

В качестве дешевого селективного восстановителя, способного превратить карбоксильную группу в спиртовую, часто используют боргидрид натрия или лития, растворенный в воде или водно-спиртовой среде, поскольку в ходе гидролиза боргидрид-иона образуется комплекс борана с водой, аналогичный комплексу борана с молекулой THF. Однако действие $\rm NaBH_4$ в условиях реакции восстановления на {\it N}-ацилированные аминокислоты приводит к расщеплению амидной связи. Поэтому карбоксильную группу предварительно активируют, превращая ее чаще всего в смешанный ангидрид. Таким образом, одностадийная в случае восстановления комплексом борана в THF реакция превращается в двухстадийную: на первой стадии получают активированное производное защищенной аминокислоты {\bf 2}, которое \emph{in situ} восстанавливают раствором боргидрида натрия.

\begin{scheme}
\begin{flushright}
\emph{Схема 1}
\end{flushright}
\includegraphics{img/reduction}
\end{scheme}

Все известные методики восстановления $\alpha$-карбоксильной группы в защищенных аминокислотах до спиртовой основываются на двух работах (\emph{Rubini, 1984; Kokotos, 1990}) и являются их незначительными модификациями. Согласно этим работам, стадию образования смешанного ангидрида необходимо осуществлять прибавлением к охлаж\-ден\-ному раствору аминокислоты в DME или THF третичного основания (NMM или TEA) с последующим добавлением хлорангидрида моноэфира угольной кислоты (IBCF или ECF). Далее в большинстве случаев гидрохлорид третичного основания удаляют фильтрованием, после чего либо к раствору боргидрида натрия прибавляют раствор интермедиата, либо, наоборот, к раствору интермедиата добавляют раствор  $\rm NaBH_4$. В ряде работ после смешивания реагентов по каплям добавляют метанол.

В ходе настоящей работы для препаративного синтеза соединения {\bf 3a} из $\gamma$-бензилового эфира {\it N}-Boc-{\it L}-глутаминовой кислоты ({\bf 1a}) были опробованы различные комбинации третичных оснований (TEA и NMM) и растворителей (THF и DME) с использованием IBCF в качестве активирующего агента. Во всех случаях образовывался липкий осадок соли {\bf 4a}, препятствующий перемешиванию реакционной массы.
Из литературы следовало, что наибольшие выходы при восстановлении защищенных дикарбоновых аминокислот наблюдали в случае использования DME в качестве растворителя и NMM в качестве третичного основания, поэтому все дальнейшие эксперименты мы проводили с использованием именно этих веществ.
%
Известно, что в ходе образования смешанного ангидрида необходимо поддерживать постоянный избыток IBCF по отношению к аминокислоте с целью подавления побочного процесса~--- образования симметричного ангидрида аминокислоты.
Поэтому нами было предложено изменить порядок добавления реагентов, а именно: к охлаж\-ден\-ному раствору IBCF в THF добавлять одновременно и с одинаковой скоростью эквимолярные растворы аминокислоты и третичного основания. 

В ходе исследования стадии восстановления \emph{in situ} полученного интермедиата {\bf 2} мы обнаружили, что оптимальным является трехкратный избыток восстановителя. Важен также порядок прибавления: к охлаж\-ден\-ному раствору смешанного ангидрида порциями следует добавлять раствор восстановителя. В противном случае мы наблюдали продукты деблокирования соединения {\bf 3a}. В качестве среды для растворения боргидрида мы выбрали водно-метанольную систему (1~:~1), поскольку в ходе пробных экспериментов ее использование давало лучшие результаты по сравнению с водным раствором $\rm NaBH_4$. 

Нами было установлено, что флеш-хроматография растворенного в этилацетате продукта через слой окиси алюминия освобождает его от примесей, являющихся, вероятно, органическими соединениями бора. Без этого этапа очистки соединения {\bf 3a} и {\bf 3c} не вступали в дальнейшие реакции конденсации по Мицунобу. 

Полученные таким образом соединения {\bf 3a}-{\bf c} были охарактеризованы с помощью \textsuperscript{1}H-ЯМР-спектроскопии. Степень чистоты подтверждали данными элементного анализа, а энантиомерную чистоту проверяли по значениям удельных углов оптического вращения, которые были аналогичны описанным в литературе.

Таким образом, в ходе работы была проведена оптимизация реакции восстановления $\alpha$-карбоксильной группы защищенных производных дикарбоновых аминокислот {\bf 1} на следующих этапах: (1) стадии получения смешанного ангидрида с моноэфиром угольной кислоты, (2) стадии восстановления \emph{in situ} этого интермедиата и (3) стадии очистки полученных $\beta$-аминоспиртов от примесей, препятствующих протеканию последующей конденсации в условиях реакции Мицунобу. Следует: (1) одновременно прибавлять два раствора (NMM и защищенной аминокислоты) к охлаж\-ден\-ному раствору IBCF; (2) к отфильтрованному от гидрохлорида {\it N}-метилморфолина и охлажденному раствору смешанного ангидрида следует в несколько приемов добавлять свежеприготовленный раствор $\rm NaBH_4$ в водно-метанольной смеси; (3) обезвоженный этилацетатный слой, содержащий продукт восстановления, следует пропускать через окись алюминия.

Синтезированные приведенным способом $\beta$-аминоспирты {\bf 3a} и {\bf 3c} были использованы для получения защищенных псевдопептидов BocGlu($\gamma$-OBzl)-\pseudo-GlyOAll ({\bf 6}) и CbzGlu($\gamma$-O\textsuperscript{t}Bu)-\pseudo(Ns)-His(Ns)OMe ({\bf 12}).

\subsubsection*{Boc-{\it L}-Glu($\gamma$-OBzl)-\pseudo-GlyOAll (6)}

Синтез защищенного псевдопептида Boc-{\it L}-Glu($\gamma$-OBzl)-\pseudo-GlyOAll ({\bf 6}) осуществляли по разработанной ранее схеме (\emph{Боярская, 2005}, \emph{Схема~2}), используя в качестве спиртовой компоненты $\beta$-аминоспирт {\bf 3a}, полученный по методу, предложенному в настоящей работе. Это позволило повысить общий выход соединения {\bf 6} исходя из {\it N}-Boc-$\gamma$-бензилового эфира {\it L}-глутаминовой кислоты ({\bf 1a}) примерно в два раза. Структуру всех полученных соединений подтверждали данными \textsuperscript{1}H-ЯМР-спектроскопии. Степень чистоты оценивали с помощью данных LC-MS и элементного анализа. Псевдопептид {\bf 6} использовали далее для синтеза мономеров ОЗ~ПНК {\bf 30a},{\bf b}.

\begin{scheme}
\begin{flushright}
\emph{Схема 2}
\end{flushright}
\includegraphics{img/glu_f_gly}
\end{scheme}

\subsubsection*{BocGly-\pseudo-{\it L}-Glu($\gamma$-OBzl)OAll (12)}

Синтез защищенного псевдопептида {\bf 12} осуществляли по известной схеме (\emph{Боярская, 2005}). Ранее {\it N}-Boc-$\alpha$-аллиловый,~$\gamma$-бензиловый эфир {\it L}-глутаминовой кислоты ({\bf 7}) получали из соединения {\bf 1a} с помощью аллилового спирта в условиях реакции Мицунобу. При этом выход соединения {\bf 7} составлял 45\%, а сама реакция протекала с образованием большого числа побочных продуктов, из-за наличия которых производное {\bf 7} выделяли при помощи колоночной хроматографии на силикагеле. Для оптимизации этой стадии нами был использован другой метод введения аллильной защитной группы в соединение {\bf 1a}: вместо аллилового спирта нами был использован аллилбромид. Реакцию осуществляли в безводном DMF в присутствии  $\rm Cs_2CO_3$. В результате полученное соединение {\bf 8} возможно было использовать в следующей стадии без дополнительной очистки, а выход на данной стадии составил 72\% (\emph{Схема~3}). Таким образом, предложенная нами модификация увеличивает общий выход псевдопептида {\bf 12} исходя из соединения {\bf 1a} примерно в два раза. Структуры всех полученных соединений подтверждали данными \textsuperscript{1}H-ЯМР-спектроскопии. Степень чистоты оценивали с помощью данных LC-MS и элементного анализа.

\begin{scheme}
\begin{flushright}
\emph{Схема 3}
\end{flushright}
\includegraphics{img/gly_f_glu}
\end{scheme}

\subsubsection*{Cbz-{\it L}-Glu($\gamma$-O\textsuperscript{t}Bu)-\pseudo(Ns)-{\it L}-His(Ns)OMe (15)}

Полностью защищенный псевдопептид {\bf 15} синтезировали с целью подтверждения возможности использования защищенных $\beta$-аминоспиртов, полученных из соответствующих производных аминокислот восстановлением $\rm NaBH_4$, в реакциях конденсации по Мицунобу с Ns-производными аминокислот (\emph{Схема~4}).
Кислотную компоненту {\bf 14} получали из метилового эфира {\it L}-гистидина ({\bf 13}) по стандартной методике.
Спиртовую компоненту {\bf 3c} получали двумя различными способами, как это было описано выше (\emph{Схема~1}), в обоих случаях реакция конденсации по Мицунобу проходила с выходом порядка 30\%. Структуры всех полученных соединений подтверждали данными \textsuperscript{1}H-ЯМР-спектроскопии. Степень чистоты оценивали с помощью данных LC-MS и элементного анализа.

\begin{scheme}
\begin{flushright}
\emph{Схема 4}
\end{flushright}
\includegraphics{img/glu_his}
\end{scheme}

\subsubsection*{Синтез защищенных псевдопептидов, содержащих остатки пролина}

Короткие пептиды на основе глицина и пролина (глипролины) обладают широкой физиологической активностью. Одним из способов изучения их субстратной активности является замена пептидной связи на псевдопептидную, в частности восстановленную пептидную связь ($\rm CH_2$-NH). Для исследования возможности конструирования псевдопептидов на основе пролина нами было предложено синтезировать псевдопептид ProGly-\pseudo-Pro. В отличие от других псевдопептидов, полученных в ходе настоящей работы, для образования псевдопептидной связи между остатками глицина и пролина не подходила реакция Мицунобу, поскольку в пролине содержится вторичная аминогруппа. Поэтому нами был выбран способ восстановительного аминирования.

Синтез двух защищенных псевдопептидов ProGly-\pseudo-Pro, содержащих различные защитные группы ({\bf 23a},{\bf b}), осуществляли согласно общей схеме (\emph{Схема~5}). В качестве исходных соединений были выбраны {\it L}-пролин и аминопропандиол ({\bf 16}). Защищенные производные {\it L}-пролина {\bf 19}, {\bf 22a} и {\bf 22b} получали по стандартным методикам ({\it Гершкович, Кибирев, 1992}).
Boc-Аминопропандиол ({\bf 17}) окисляли периодатом калия с образованием Boc-аминоацетальдегида ({\bf 18}) ({\it Kim L. et al., 1993}). Реакция протекала быстро и с высоким выходом (78\%). Ввиду неустойчивости соединения {\bf 18}, его без дополнительной очистки сразу вводили в следующую стадию. 

\begin{scheme}
\begin{flushright}
\emph{Схема 5}
\end{flushright}
\includegraphics{img/progly_f_pro}
\end{scheme}

Реакцию восстановительного аминирования проводили в DCM при комнатной температуре с использованием STAB и TEA с выходом защищенного псевдопептида {\bf 20} 75\%. При удалении Boc-группы в интермедиате {\bf 20} раствором HCl в диоксане или свежеприготовленными одно- и двухмолярными растворами HCl в абсолютном метаноле наблюдали частичное осмоление продукта, поэтому стадии удаления Boc-защитных групп в соединениях {\bf 20} и {\bf 23a} проводили действием 50\% раствора TFA в DCM при 0\textcelsius, получая маслообразные трифторацетаты {\bf 21} и {\bf 24a}. 

Стадии конденсации псевдопептида {\bf 21} c защищенными по аминогруппе производными пролина {\bf 22a},{\bf b} проводили по методу смешанных ангидридов с использованием IBCF или PivCl. В первом случае наблюдали образование ряда побочных продуктов, неразделяемых хроматографически, что приводило к низкому выходу соединений {\bf 23a},{\bf b} (порядка 20\%), в то время как использование PivCl приводило к б\'{о}льшим выходам (порядка 50\%). С помощью ТСХ-контроля было показано, что активация BocPro ({\bf 22a}) и CbzPro ({\bf 22b}) при действии PivCl протекает довольно быстро~--- примерно за минуту при загрузке 1 г BocPro. В случае использования соединения {\bf 22a} увеличение времени активации приводило к  разрушению или модификации смешанного ангидрида защищенного пролина, а также сопровождалось протеканием побочной стадии циклизации нейтрализованной соли {\bf 21} с образованием лактама {\bf 25}. Поэтому, с одной стороны, следовало избегать большого избытка третичного основания (TEA) в начальный момент времени в реакционной смеси, с другой стороны, недостаточное количество TEA приводило к неполной конверсии активированного производного пролина, что также снижало выход. Поэтому мы предложили использовать шестикратный избыток третичного основания, однако для уменьшения скорости реакции циклизации TEA добавляли порциями. Ввиду хорошей растворимости защищенных псевдопептидов {\bf 23a},{\bf b} в воде, количество водно-органических обработок сводили к минимуму с целью избежания дополнительных потерь на стадии выделения. 

Полностью защищенные соединения {\bf 20} и {\bf 23a},{\bf b} с псевдопептидным фрагментом обладают основными свойствами из-за наличия свободной аминогруппы и третичного атома азота, что осложняет их выделение. Поэтому для хроматографической очистки этих соединений нами были подобраны системы элюентов, содержащие TEA. Удаление Boc-защитной группы в соединении {\bf 23a} осуществляли действием 50\% раствора TFA в DCM с количественным выходом. Структуры всех полученных соединений подтверждали данными \textsuperscript{1}H-ЯМР-спектроскопии. Степень чистоты оценивали с помощью данных LC-MS и элементного анализа.

Таким образом, в ходе данного этапа работы была показана принципиальная возможность синтеза псевдопептидов, содержащих пролин.

\clearpage

\subsection*{Синтез мономеров ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu}

Первоначально для синтеза цитозинсодержащих мономеров ОЗ~ПНК была опробована разработанная ранее схема получения тиминсодержащих мономеров ОЗ~ПНК из защищенных псевдопептидов Boc-{\it L}-Glu($\gamma$-OBzl)-\pseudo-GlyOAll ({\bf 6}) и BocGly($\gamma$-OBzl)-\pseudo-{\it L}-GluOAll ({\bf 12}) (\emph{Боярская, 2005}).
Однако выход менее 10\% на стадии конденсации псевдопептида {\bf 12} с карбоксиметилированным производным Cbz-цитозина {\bf 28b} оказался неприемлемым для дальнейшего препаративного получения мономера {\bf 33b} (\emph{Схема~8}).
Другая стратегия синтеза, разработанная для получения незаряженных мономеров ПНК ({\it Meltzer et al., 1995}), предполагала {\it N}-алкилирование защищенных нуклеиновых оснований {\bf 27} бромацильными производными псевдопептидов {\bf 26} и {\bf 31}. Последние, в свою очередь, получали, действуя на псевдопептиды {\bf 6} и {\bf 12} бромацетилбромидом в DCM в присутствии TEA. Выходы бромацилированных псевдопептидов {\bf 26} и {\bf 31} составили 78 и 86\%, соответственно (\emph{Схемы~7, 8}).

\begin{scheme}
\begin{flushright}
\emph{Схема 6}
\end{flushright}
\includegraphics{img/thy_cyt_ade}
\end{scheme}

Способ, использовавшийся ранее для получения тиминсодержащих мономеров ОЗ~ПНК, основан на реакции ацилирования псевдопептидов карбоксиметилированными производными нуклеиновых оснований {\bf 28a}-{\bf c}, полученных из соответствующих гетероциклических нуклеиновых оснований (\emph{Схема~6}), как это было описано ранее (\emph{Nielsen, 1991}). Ввиду невозможности селективной защиты этилового эфира (аденил-9)уксусной кислоты ({\bf 37}) CbzCl, защита экзоциклической аминогруппы была проведена с помощью тетрафторбората {\it N}-(бензилоксикарбонил)-{\it N\textquotesingle}-этилимидазолия (реагента Рапопорта), который, в отличие от бензилоксикарбонилхлорида, позволяет провести ацилирование экзоциклической аминогруппы в соединении {\bf 37} с более высоким выходом.
Суммарные выходы для соединений {\bf 28a}-{\bf c} составляли 70, 15 и 17\%, соответственно. 

Путь, включающий реакцию алкилирования соединений {\bf 27a}-{\bf c} бромацильными производными защищенных псевдопептидов {\bf 26} и {\bf 31}, требует меньшего числа стадий для модификации исходных гетероциклов. Cbz-производное цитозина {\bf 27b} получали в одну стадию из цитозина ({\bf 34}) с помощью CbzCl в Py с выходом 75\%, а \textsuperscript{Cbz}Ade ({\bf 27c})~--- действием на аденин ({\bf 36}) CbzCl и NaH в DMF с выходом 26\%.
Невысокий выход реакции получения \textsuperscript{Cbz}Ade ({\bf 27c}) был связан с образованием побочных продуктов взаимодействия бензилоксикарбонилхлорида c аденином по {\it N}-9 положению. Целевые продукты {\bf 27b},{\bf c} выделяли с помощью кристаллизации. Структуру \textsuperscript{Cbz}Cyt ({\bf 27b}) подтверждали данными элементного анализа. Структуру \textsuperscript{Cbz}Ade ({\bf 27c}) подтверждали данными \textsuperscript{1}H-ЯМР-спектроскопии.

Синтез полностью защищенных цитозинсодержащих мономеров {\bf 29b} и {\bf 32b} осуществляли с помощью реакции алкилирования \textsuperscript{Cbz}Cyt ({\bf 27b}) полученными бромацилированными псевдопептидами {\bf 26} и {\bf 31} (\emph{Схемы 7, 8}).
Пробные реакции проводили в DMF, используя K$\mathrm{_2}$CO$\mathrm{_3}$ и NaH в качестве оснований, при этом выходы оказались сравнимы.
 На стадии конденсации \textsuperscript{Cbz}Cyt ({\bf 27b}) с бромпроизводным псевдопептида Glu-\pseudo-Gly {\bf 26} мы использовали K$\mathrm{_2}$CO$\mathrm{_3}$, что давало продукт {\bf 29b} с выходом 39\% и в расчете на исходный псевдопептид {\bf 6} составляло 30\%.
Конденсацию \textsuperscript{Cbz}Cyt ({\bf 27b}) с бромпроизводным псевдопептида Gly-\pseudo-Glu {\bf 31} осуществляли в присутствии NaH и K$\mathrm{_2}$CO$\mathrm{_3}$ в DMF с выходами 60\% и 55\%, соответственно.
В расчете на исходный псевдопептид {\bf 12} выход соединения {\bf 32b} составил 52\% при использовании NaH в качестве основания на стадии алкилирования.
Цитозинсодержащие мономеры ОЗ~ПНК {\bf 30b} и {\bf 33b} получали удалением $\alpha$-аллильной защитной группы с помощью палладиевого катализатора~--- тетракис(трифенилфосфин)палладия (0) [Pd(PPh$\mathrm{_3}$)$\mathrm{_4}$]. Выход в реакциях составил 92 и 47\%  для соединений {\bf 30b} и {\bf 33b}, соответственно. 

С целью проверки универсальности разработанной для получения цитозинсодержащих мономеров ОЗ~ПНК схемы мы провели синтез двух ранее полученных в нашей лаборатории тиминсодержащих мономеров ОЗ~ПНК {\bf 30a} и {\bf 33a} (\emph{Схемы 7, 8}). Стадии алкилирования бромацилированными псевдопептидами {\bf 26} и {\bf 31} тимина ({\bf 27a}) проводили в DMF, используя K$\mathrm{_2}$CO$\mathrm{_3}$ и NaH в качестве оснований. Выходы в случае использования обоих оснований оказались сравнимы, поэтому полупрепаративные синтезы осуществляли в присутствии K$\mathrm{_2}$CO$\mathrm{_3}$, чтобы избежать возможных побочных процессов в случае использования более реакционноспособного NaH.
Полностью защищенные тиминсодержащие мономеры {\bf 29a} и {\bf 32a} были получены через стадию алкилирования тимина бромацильными производными {\bf 26} и {\bf 31} с выходами 56 и 91\%, соответственно, что в расчете на исходные псевдопептиды {\bf 6} и {\bf 12} давало суммарные выходы 43 и 78\%.
Для сравнения, конденсация по ранее использованной схеме, включающей реакцию ацилирования псевдопептидов {\bf 6} и {\bf 12} карбоксиметилированным производным тимина {\bf 28a}, давала полностью защищенные тиминсодержащие мономеры ОЗ~ПНК {\bf 29a} и {\bf 32a} с выходами 56 и 64\%, соответственно.
Тиминсодержащие мономеры ОЗ~ПНК {\bf 30a} и {\bf 33a} получали удалением $\alpha$-аллильной защитной группы с помощью [Pd(PPh$\mathrm{_3}$)$\mathrm{_4}$] с выходами 99 и 45\%. 

\begin{scheme}
\begin{flushright}
\emph{Схема 7}
\end{flushright}
\includegraphics{img/glu_gly_pyrimidine}
\end{scheme}

\begin{scheme}
\begin{flushright}
\emph{Схема 8}
\end{flushright}
\includegraphics{img/gly_glu_pyrimidine}
\end{scheme}

Разработанная в ходе настоящей работы для пиримидиновых нуклеиновых оснований схема была также опробована для получения ранее синтезированного аденинсодержащего мономера {\bf 33c} на основе защищенного псевдопептида Gly-\pseudo-Glu {\bf 12} (\emph{Прохоров, 2005}), который первоначально получали реакцией ацилирования карбоксиметилированным производным Cbz-аденина ({\bf 28c}) псевдопептида {\bf 12} с выходом 26\% (\emph{Схема~8}).
Конденсацию по альтернативной схеме, включающей алкилирование соединения {\bf 27c} бромацилированным псевдопептидом {\bf 31}, проводили в безводном DMF, используя в качестве оснований NaH, K$\mathrm{_2}$CO$\mathrm{_3}$, а также K$\mathrm{_2}$CO$\mathrm{_3}$ в присутствии Cs$\mathrm{_2}$CO$\mathrm{_3}$. Наилучшие результаты наблюдали в третьем случае.
 В ходе реакции образовывался побочный продукт алкилирования по {\it N}-7 положению соединения {\bf 27c}, что было подтверждено данными \textsuperscript{1}Н-ЯМР-спектроскопии и LC-MS. Идентификация и оценка количества побочного продукта были затруднены в связи с возможностью существования различных конформационных форм продукта относительно амидной связи. Примерное соотношение продуктов алкилирования по {\it N}-9 и {\it N}-7 положениям составило 4:1. Защищенный по $\alpha$-карбоксильной группе аденинсодержащий мономер {\bf 32c} был выделен с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (система метанол~--- вода, 75~:~5). Полностью защищенный аденинсодержащий мономер {\bf 32c} получали с выходом 41\%, что в расчете на исходный псевдопептид {\bf 12} составило 35\%.
Удаление аллильной защитной группы в соединении {\bf 32c} осуществляли с помощью [Pd(PPh$\mathrm{_3}$)$\mathrm{_4}$]. Выход соединения {\bf 33c} составлял 53\%.

Сравнивая два метода синтеза мономеров ОЗ~ПНК, можно сделать вывод о том, что в целом способ, основанный на реакции алкилирования бромацилированными псевдопептидами {\bf 26} и {\bf 31} нуклеиновых оснований {\bf 27a}-{\bf c}, дает лучшие выходы в расчете на исходные псевдопептиды {\bf 6} и {\bf 12}. Кроме того, отпадает необходимость получения карбоксиметилированных производных нуклеиновых оснований, что особенно актуально в случае модификации аденина.
Следует также отметить, что бромацилированные псевдопептиды {\bf 26} и {\bf 31} удобно хранить, в отличие от соответствующих псевдопептидов {\bf 6} и {\bf 12}, склонных к циклизации при хранении.

Таким образом, была подобрана и отработана оптимальная схема синтеза цитозинсодержащих мономеров ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов {\bf 6} и {\bf 12}, пригодная также, на наш взгляд, для получения и других мономеров заряженных ПНК. Впервые получены и охарактеризованы  два цитозинсодержащих мономера ОЗ~ПНК.

\subsection*{ЯМР-эксперименты по доказательству структуры полностью защищенных мономеров ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов Gly-\pseudo-Glu и Glu-\pseudo-Gly}

Для подтверждения структуры полностью защищенных мономеров ОЗ~ПНК {\bf 29} и {\bf 32}, полученных в ходе реакции алкилирования бромацильными производными {\bf 26} и {\bf 31} нуклеиновых оснований {\bf 27}, данных одномерных \textsuperscript{1}H- и \textsuperscript{13}C-ЯМР-спектров недостаточно. Поэтому были проведены ЯМР-эксперименты по соотнесению сигналов ядер \textsuperscript{13}C и \textsuperscript{1}H в полностью защищенных мономерах ОЗ~ПНК {\bf 32a}-{\bf c} на основе псевдопептида Gly-\pseudo-Glu, а также цитозинсодержащего мономера ОЗ~ПНК {\bf 29b} на основе псевдопептида Glu-\pseudo-Gly с привлечением двумерных методик \textsuperscript{1}H/\textsuperscript{1}H-спектров COSY и \textsuperscript{13}C/\textsuperscript{1}H-спектров HSQC, показывающих ближние взаимодействия ядер атомов, и \textsuperscript{13}C-\textsuperscript{1}H-спектров HMBC, основанной на дальних взаимодействиях.
Спектры регистрировали\footnote{ЯМР-спектрометрический анализ мономеров ОЗ ПНК проводился совместно с \mbox{ГНИИХТЭОС} при участии Чешкова Д.~А.} в дейтерированном ацетоне при 303K на приборе Bruker AVANCE-600 с рабочей частотой 150.92 МГц для ядер \textsuperscript{13}C и 600.13 МГц для ядер \textsuperscript{1}H.
В качестве реперных использовали сигналы  ядер \textsuperscript{13}C входящих в состав полностью защищенных мономеров ОЗ~ПНК защитных групп (Boc, Cbz, Bzl) и гетероциклических нуклеиновых оснований (Thy, Cyt, Ade).

На \emph{Рис.~\ref{fig:gly-glu_hmbc_numbering}} приведены общие формулы всех  синтезированных в ходе настоящей работы мономеров ОЗ~ПНК и указана нумерация атомов углерода и водорода, которым соответствуют соотнесенные на фрагментах HMBC-спектров сигналы в \textsuperscript{13}C- и \textsuperscript{1}H-ЯМР-спектрах
(\emph{Рис.~\ref{fig:cyt(gly-glu)_hmbc}--\ref{fig:thy_ade_hmbc}}).

\begin{figure*}
   \begin{center}
   \includegraphics{img/gly-glu_hmbc_numbering}
   \end{center}
   \caption{Нумерация атомов псевдопептидного фрагмента в мономерах ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu.}
   \label{fig:gly-glu_hmbc_numbering}
\end{figure*}   

Вследствие наложения друг на друга в спектрах \textsuperscript{13}C и \textsuperscript{1}H ЯМР сигналов ядер атомов одного бензольного кольца в тиминсодержащем мономере {\bf 32a} и двух бензольных колец в двух цитозин- и одном аденинсодержащем мономерах ОЗ~ПНК ({\bf 29b} и {\bf 32b,c}), соотнесение сигналов внутри этих групп не осуществлялось. Суммарная интенсивность сигналов этих фенильных групп соответствовала ожидаемой (5H для тиминсодержащего мономера {\bf 32a} и  10Н  для цитозин- и аденинсодержащих мономеров {\bf 29b} и {\bf 32b},{\bf c}).

Для тимин-, цитозин- и аденинсодержащего мономеров на сигналы остатков соответствующих гетероциклов в спектрах HMBC имеются кросс-пики только от одной метиленовой группы, а именно СH$\mathrm{_{2}}$-25.

\begin{figure*}
   \begin{center}
   \includegraphics{img/cyt(gly-glu)_hmbc}
   \end{center}
   \caption{Фрагмент HMBC-спектра полностью защищенного цитозинсодержащего мономера ОЗ~ПНК ({\bf 32b}) на основе псевдопептида Gly-\pseudo-Glu.}
   \label{fig:cyt(gly-glu)_hmbc}
\end{figure*}

\begin{figure*}
   \begin{center}
   \includegraphics{img/cyt(glu-gly)_hmbc}
   \end{center}
   \caption{Фрагмент HMBC-спектра полностью защищенного цитозинсодержащего мономера ОЗ~ПНК ({\bf 29b}) на основе псевдопептида Glu-\pseudo-Gly.}
   \label{fig:cyt(glu-gly)_hmbc}
\end{figure*}

\begin{figure*}
   \begin{center}
   \includegraphics{img/thy_ade_hmbc}
   \end{center}
   \caption{Фрагменты HMBC-спектров полностью защищенных (a) тимин-  и (b) аденинсодержащих мономеров ОЗ~ПНК ({\bf 32a,c}) на основе псевдопептида Gly-\pseudo-Glu.}
   \label{fig:thy_ade_hmbc}
\end{figure*}

% цитозин

Структуру цитозинсодержащих мономеров ОЗ~ПНК {\bf 29b} и {\bf 32b} подтверждали наличием в HMBC-ЯМР-спектрах (\emph{Рис.~\ref{fig:cyt(gly-glu)_hmbc}, \ref{fig:cyt(glu-gly)_hmbc}}) корреляций H25--C26, H25--C29 и H26--C25. Корреляция H25--C28, возможная в случае алкилирования бромацильным производным защищенного цитозина по положению {\it N}-3, на обоих спектрах отсутствует.

% тимин

Структуру тиминсодержащего мономера ОЗ~ПНК {\bf 32a} подтверждали наличием в HMBC-ЯМР-спектре (\emph{Рис.~\ref{fig:thy_ade_hmbc}a}) корреляций H25--C26, H25--C31 и H26--C25. Корреляция H25--C29, возможная в случае алкилирования бромацильным производным тимина по положению {\it N}-3, отсутствует.

% аденин
Структуру аденинсодержащего мономера ОЗ~ПНК {\bf 32c} подтверждали наличием корреляции H25--C30 и H25--C26. Корреляция H26--C25 в HMBC-ЯМР-спектре (\emph{Рис.~\ref{fig:thy_ade_hmbc}b}) аденинсодержащего мономера ({\bf 32c}) есть, однако при указанной на рисунке интенсивности пиков она не видна. Корреляция H25--C27 на этом спектре не проявляется, что позволяет судить об отсутствии в образце изомерного целевому соединению продукта алкилирования бромацилированным псевдопептидом \textsuperscript{Cbz}Ade по положению {\it N}-7.

\clearpage

\subsection*{Выводы}

\begin{enumerate}
\item Разработан новый метод восстановления дикарбоновых $\alpha$-амино\-кислот.

\item Впервые синтезированы два защищенных производных псевдопептида ProGly-\pseudo-Pro.

\item Впервые осуществлен синтез двух цитозинсодержащих мономеров ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu.

\item Проведена оптимизация схемы синтеза полученных ранее двух тиминсодержащих мономеров ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu и одного аденинсодержащего мономера ОЗ~ПНК на основе псевдопептида  Gly-\pseudo-Glu.

\item Проведен анализ структуры полученных по разработанной в ходе настоящей работы схеме тимин-, цитозинсодержащих мономеров ОЗ~ПНК на основе псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu, а также аденинсодержащего мономера ОЗ~ПНК на основе псевдопептида Gly-\pseudo-Glu с помощью методов двумерной ЯМР-спектроскопии, который показал однозначность структуры выделенных продуктов реакции алкилирования гетероциклических нуклеиновых оснований бром\-ациль\-ными производными защищенных псевдопептидов Glu-\pseudo-Gly и Gly-\pseudo-Glu.

\end{enumerate}

\clearpage

\subsection*{Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:}

\begin{enumerate}
\item   Баранов~А.~В., Прохоров~Д.~И., Боярская~Н.~П., Есипова~О.~В., Кириллова~Ю.~Г. Синтез нового аналога пептида ProGlyPro.~// Вестник МИТХТ. -- 2006. -- Т.~1, \No~6. -- С.~77--80.

\item   Баранов~А.~В., Цвид~Н.~С., Лукьянченко~В.~И., Прохоров~Д.~И., Кириллова~Ю.~Г., Швец~В.~И. Исследование путей синтеза цитозинового мономера отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот.~// Вестник МИТХТ. -- 2007. -- Т.~2, \No~5. -- С.~28--32.

\item   Боярская~Н.~П., Прохоров~Д.~И., Баранов~А.~В. Разработка универсального подхода к синтезу мономеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот.~// III Московский международный конгресс <<Биотехнология: состояние и перспективы развития>>. --- Москва, 2005. -- Ч.~1. -- С.~142--143.

\item Баранов~А.~В., Льянов~М.~А., Лукьянченко~В.~И., Прохоров~Д.~И. Синтез хиральных мономеров пептидно-нуклеиновых кислот.~// II молодежная научно-техническая конференция <<Наукоемкие химические технологии>>. Москва. --- 2007. --- Т.~1. --- С.~34.

\item Баранов~А.~В., Кириллова~Ю.~Г. Синтез псевдопептидных фрагментов для получения негидролизуемых аналогов физиологически активного пептида СЕМАКС.~// Третий съезд общества биотехнологов России им. Ю.~А.~Овчинникова. Москва. --- 2005. --- С.~31--32.

\end{enumerate}